用户文章 断奶改变猪的肠道微生物区系进而调节肠道中营养代谢相关的基因表达 | 微生物专题

发表期刊：Frontiers in Microbiology

发表时间：2020年4月17日

影响因子：4.3

研究内容:本研究发现仔猪断奶会重塑猪的肠道微生物区系和短链脂肪酸（SCFAs）组成，进而调节肠道中脂肪酸代谢、胆汁酸代谢和氧化应激相关的基因表达。

技术手段：转录组测序+16s rRNA测序

材料和方法

选择6头母猪(3-4胎次)在妊娠期和哺乳期饲喂相同的饲料，每窝生育9 ~ 11头仔猪，仔猪在哺乳期21天断奶。在断奶当天(21日龄)上午，从每窝中选择1只接近平均体重的雄性乳猪，进行屠宰取样。随后，每窝仔猪都转移到保育舍，自由饮水，饲喂同样的饲料。在断奶后7天(28日龄)，从每窝中选择1只雄性断奶仔猪屠宰。收集新鲜粪便(直肠内容物)，立即保存于−80℃用于后续微生物区系分析和SCFAs分析。共11个样品，断奶组5个生物学重复，未断奶组6个生物学重复。空肠组织冲洗后立即储存在−80℃用于后续RNA-seq分析。共6个样品，断奶组、未断奶组各3个生物学重复。

研究结果

1. RNA-seq

1）RNA-seq分析及qRT -PCR结果分析

哺乳仔猪与断奶仔猪之间鉴定到456个DEGs，其中上调基因234个，下调基因222个。与哺乳仔猪相比，断奶仔猪过氧化氢酶（CAT）、肉毒碱棕榈酰转移酶2 (CPT2)、脂肪酸结合蛋白1 (FABP1)和乳酸脱氢酶(LDHA)显著降低(P < 0.05)。此外，断奶仔猪的谷胱甘肽过氧化物酶2 (GPX2)、铁氧还蛋白还原酶(FDXR)和超氧化物歧化酶3 (SOD3)的相对表达水平较哺乳仔猪显著升高(P < 0.05)。SLC1A5的相对表达量受断奶影响不显著，但呈上升趋势(P = 0.08)。总的来说，经qRT-PCR验证的大部分基因的表达趋势与RNA-seq分析结果一致。

图1哺乳仔猪和断奶仔猪肠道内容物RNA-seq分析

2）GO富集分析

对456个DEGs进行GO分析。共富集到251个GO terms，其中涉及生物学过程的145个，细胞组分17个，分子功能89个。前10位的GO terms属于生物学过程的范畴。与运输、氧化还原过程、跨膜运输相关的GO terms占主导地位，其次是代谢过程、负调控NF-kappaB转录因子活性、糖酵解过程和线粒体凋亡变化。27个基因富集于转运过程，15个基因富集于代谢过程，24个基因富集于氧化还原过程。细胞组分的前10个GO terms包括细胞膜、过氧化物酶体、脂质颗粒和核小体。共146个基因富集于膜系统。

图2 DEGs GO功能富集分析中生物学过程分类

图3 DEGs 的GO功能富集分析中分子功能分类

如图所示，氧化还原酶活性、转运蛋白活性、胆汁酸结合等分子功能是GO富集的前10位。19个基因富集于氧化还原酶活性，这些基因与富集于氧化还原过程的基因相似，在这两个相关的氧化应激的通路里,共富集到24个基因,其中7个基因上调，17个基因下调。此外，利用数据库对这些基因编码的蛋白质相互作用网络进行了预测和构建。发现有15种蛋白质与其他蛋白质相互作用。如图4所示,CAT与ACADSB, GPX2, HSD17B4，IYD, LDHA和SOD3六种蛋白质相互作用；GPD1与ACADSB、GPD1L和LDHA三种蛋白相互作用;ACADSB与CAT、GPD1、HSD17B4三种蛋白相互作用；GPX2与CAT和SOD3相互作用。此外，研究还观察到与胆汁酸代谢相关的5个GO terms (如图5A所示)，包括胆汁酸代谢过程、胆汁酸和胆盐运输、细胞内胆汁酸受体信号通路、胆汁酸结合和胆汁酸受体活性。共富集到4个基因，分别为FABP6、farnesoid X receptor (FXR或NR1H4)、SLC51A、ENSSSCG00000026317，均在断奶仔猪中有所增加。此外，研究还发现这些基因编码的蛋白在STRING分析中存在明显的相互作用(图5B)。

图4氧化应激相关DEGs编码蛋白的相互作用网络

图5与胆汁酸代谢有关的GO terms

KEGG共分析出14条通路(表1)，其中与营养吸收相关的通路有2条，分别为矿物质吸收和硫传递系统，与营养代谢相关的通路有6条，分别为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢;精氨酸和脯氨酸代谢;乙醛酸和二羧酸代谢;脂肪酸代谢;过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR)信号通路和氮代谢。此外，还富集到与营养合成和消化酶分泌相关的5条途径，包括胰腺分泌、唾液分泌、氨基酸生物合成和叶酸生物合成。

2. 微生物区系分析

1）微生物组成差异

Shannon、Simpson和Chao1指数分析表明在哺乳仔猪和断奶仔猪之间的多样性没有显著差异(图6A)。基于unweighted Unifrac distance-based PCoA的分析结果，哺乳仔猪和断奶仔猪的微生物菌群组成是独立分布的(图6B)。在门水平上(图7A)，哺乳仔猪粪便菌群由拟杆菌门(45.37±4.76%)、厚壁菌门(31.93±4.51%)、梭杆菌门(10.69±3.35%)、变形杆菌门(5.63±0.90%)、螺旋菌门(3.79±0.95%)和放线菌门(0.34±0.10%)组成。断奶仔猪粪便菌群由拟杆菌门(46.51±3.80%)、厚壁菌门(48.56±4.04%)、变形杆菌门(1.48±0.24%)、螺旋体(0.17±0.04%)和放线菌门(0.27±0.04%)组成。随着断奶时间的延长，厚壁菌门的丰度和厚壁菌门/拟杆菌门比值增加(P < 0.05)(图7C)。断奶后梭菌、变形菌和小孢子菌的菌群丰度均下降(P < 0.05)。值得注意的是，梭杆菌的丰度明显下降，从10.69±3.35%下降到0.01±0.001%，表明这些细菌在断奶后几乎消失。在属水平上(图7B)，梭杆菌属和普氏杆菌属是哺乳仔猪中最常见的属，其次是普氏杆菌属、unclassified瘤胃球菌属、拟杆菌属和乳酸菌属。在断奶仔猪中，普列沃氏菌、unclassified毛螺菌科和乳酸菌属是最常见属，其次是unclassified瘤胃球菌属、Roseburia属、Alloprevotella属和Paraprevotella属。如图8A、B所示，断奶后普列沃氏菌属、unclassified拉氏藻属、蔷薇菌属、XlV a型梭状芽胞杆菌属、链球菌属、粪小杆菌属、Oscillibacter属、瘤胃球菌属等的丰度增加(P < 0.05)。Prevotella的丰度在断奶仔猪中显著增加，从哺乳仔猪中的16.51±4.81%增加到29.23±3.62%。断奶过程中，拟杆菌属、梭菌属、unclassified梭菌属、羊肠菌属、幽门杆菌属、巨羊肠菌属、大肠杆菌属、绒毛膜菌属、放线杆菌属的丰度降低(P < 0.05)。拟杆菌在断奶仔猪中的比例由6.67±1.06%降至0.55±0.1%。断奶仔猪中梭杆菌的比例从9.56±2.59%下降到0.01±0.003%。

图6哺乳仔猪和断奶仔猪肠道菌群的Alpha及beta多样性

图7哺乳仔猪和断奶仔猪肠道菌群组成

图8哺乳仔猪与断奶仔猪肠道菌群在属水平的差异

利用PICRUSt预测了仔猪断奶期间肠道菌群的功能分布变化，如图9所示。这些途径参与氨基酸、碳水化合物和脂质代谢。氨基酸代谢方面，断奶仔猪中组氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解、苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、d -谷氨酰胺、d -谷氨酸代谢等相关通路均下降(P < 0.05)。在碳水化合物代谢方面，断奶仔猪中淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢途径增加(P < 0.05)，柠檬酸循环(TCA循环)、肌糖磷酸代谢途径下降(P < 0.05)。在脂质代谢方面，断奶仔猪α-亚麻酸代谢、PPAR信号通路、脂肪细胞因子信号通路均下降(P < 0.05)。此外，研究还观察到断奶仔猪视黄醇代谢相关通路增加(P < 0.05)。

图9 利用PICRUSt 预测16S rRNA标记基因功能图谱

3）粪便中的SCFAs浓度

测定不同处理仔猪粪便样品中SCFAs浓度。断奶仔猪粪便中醋酸盐和丁酸盐的浓度高于哺乳仔猪(P < 0.05)(图10)。断奶对粪便中的丙酸盐和戊酸盐浓度的影响不显著(P > 0.05)。

图10 哺乳仔猪和断奶仔猪粪便中短链脂肪酸（SCFA）浓度

总结

本研究结果表明，断奶过程改变了猪肠道内参与营养吸收、运输和代谢过程的基因表达。断奶过程显著增加了猪粪中厚壁菌门的丰度和厚壁菌门/拟杆菌门比值，降低了猪粪中变形杆菌门和梭杆菌门的丰度。与未断奶仔猪相比，断奶仔猪中拟杆菌和梭杆菌的丰度明显降低，而普氏杆菌的丰度明显升高。断奶过程增加了粪便中丁酸盐和乙酸盐的含量。断奶过程中肠道基因表达的改变可能与肠道菌群组成和SCFAs水平的改变有关。但是，宿主基因表达与猪断奶过程中肠道菌群的相互作用还有待进一步研究。

该文章由联川项目经理甄彦朝解读

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